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                        热门词:生物显微镜 水质分析仪 微波消解 荧光定量PCR 电化学工作站 生物安全柜

                        现在位置首页>技术资料首页>行业动态>公司动态>Amplite?荧光法总NADP/NADPH检测试剂盒 *红色荧光*

                        Amplite?荧光法总NADP/NADPH检测试剂盒 *红色荧光*

                        西安百萤生物科技有限公司2018年10月24日 9:20 点击:219

                        基本信息

                        货号:15261

                        储存条件:保存在冰箱里,避光

                        适用仪器:吸光板酶标仪

                         

                        简介

                        ?#26465;?#33018;腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和?#26465;?#33018;腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是在细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADHNAD +的还原形式,NAD +NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中,NADP是一种在光合作用的初步反应中很重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

                        现有的NAD / NADH方法具有低灵敏度和高干扰,因为测定在UV范围内进行。 我们的Amplite?比色总NADNADH检测试剂盒为敏感检测NADNADH提供了一种便捷的方法。 ?#20302;?#20013;的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH,其显着提高了检测灵敏度。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在较长波长范围内进行,这显着降低了生物样品引起的干扰。 也没有必要从样品混合物中纯化NAD / NADH。 该试验证明了高灵敏度和低约576nm处吸光度的干扰。

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                        Amplite?比色NAD / NADH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测,可在100μL检测体积(300 nM;1)中检测少至30皮摩尔的NADH)。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm~570nm~605nm的吸光度比下轻松读取,以提高测定灵敏度。

                         

                        试剂盒特点

                        广泛应用:可用于量化溶液和细胞提取物中的NAD / NADH

                        敏感:在溶液中检测低至30皮摩尔的NAD / NADH

                        连续性:无需分离步骤?#32431;?#36731;松适应自动化。

                        方便?#21495;?#26041;具有最小的手动操作时间。 不需要洗涤。

                        非放射性:对废物处理没有特殊要求。

                         

                        试剂盒组成

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                        96孔板的检测方案

                        简要概括

                        准备NAD / NADH反应混合物(50μL)?

                        添加NADH标准品或测试样品(50μL)?

                        在室温下孵育15分钟 - 2小时?

                        监测吸光度在575±5 nm处增加

                        注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

                         

                        操作步骤

                        1.准备NADH储备溶液:

                        200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM1nmol /μLNADH储备溶液。

                        注意?#20309;词?#29992;的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 oC

                        2.准备NAD / NADH反应混合物:

                        10mL NAD / NADH传感器缓冲液(组分B)加入NAD / NADH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

                        注意:此解决方案足以用于两个96孔板。 任何?#35789;?#29992;的NAD / NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

                        3.准备NADH标准品的系列稀释液(010μM):

                        3.110μLNADH储备液(来自步骤1)加入990μLPBS缓冲液(pH 7.4)中,生成10μM稀释的NADH标准溶液。

                        注意?#21512;?#37322;的NADH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

                        3.2200μL10μM标准溶液进行13连续稀释,得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.010μM连续稀释液。

                        3.3如表12中所述,将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/?#35813;?#24213;96孔微孔板中。

                        注意:根据需要准备细胞或组织样本。

                         

                        1白色/?#35813;?#24213;96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

                        1540342181(1).jpg

                        注意:NS = NADH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。

                         

                        2每个孔的试剂组成

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                        注意:*将连续稀释的NADH标准品(0.01μM10μM)加入NS1NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADH(例如,>100μM,最终浓度)可能由于NADH传感器的过度氧化而导致信号降低。

                         

                        4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定:

                        4.150μLNADH反应混合物(来自步骤2)加入NADH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤3.3)的每个孔中,使总NADH测定体积为100μL/孔。

                        注意:对于384孔板,每?#20934;?#20837;25μL样品和25μLNADH反应混合物。

                        4.2在室温下孵育反应15分钟至2小?#20445;?#36991;光。

                        4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或吸光度比为~570 nm~605 nm?#24405;?#27979;吸光度的增加,以提高检测灵敏度。

                        1:对于NAD / NADH比率测量,建议使用?#20934;?/span>15263

                        2:对于基于细胞的NAD / NADH测量,建议使用ReadiUse?哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *Cat#20012)裂解细胞。

                         

                        数据分析

                        空白孔中的吸光度(仅使用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

                        注意:吸光度背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。

                        1540342261(1).jpg

                        1.使用NOVOStarBMG Labtech)酶标仪在白色/?#35813;?#24213;96孔板中用Amplite TM比色Totlal NADNADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小?#20445;?/span>n = 3)时可以检测到低至300nM30pmol /孔)的NADH,而NADPH没有响应。

                        参考文献

                        1. Ziegenhorn J, Senn M, Bucher T. (1976) Molar absorptivities of beta-NADH and beta-NADPH. Clin Chem, 22, 151.

                        2. Ikegami T, Kameyama E, Yamamoto SY, Minami Y, Yubisui T. (2007) Structure and Properties of the Recombinant NADH-Cytochrome b(5) Reductase of Physarum polycephalum. Biosci Biotechnol Biochem.

                        3. Kimura N, Fukuwatari T, Sasaki R, Shibata K. (2006) Comparison of metabolic fates of nicotinamide, NAD+ and NADH administered orally and intraperitoneally; characterization of oral NADH. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 52, 142.

                        4. O'Donnell JM, Kudej RK, LaNoue KF, Vatner SF, Lewandowski ED. (2004) Limited transfer of cytosolic NADH into mitochondria at high cardiac workload. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286, H2237.

                         

                         

                         


                        (来源: 西安百萤生物科技有限公司


                        全年征稿 / 资讯合作

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